間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)具有多向分化的潛能,在體外一定條件下可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞。
如何做好干細(xì)胞誘導(dǎo)分化?
成骨
1. 接種hMSC:用MSC Attachment solution 預(yù)包被24孔盤,每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF,接種6x104細(xì)胞 (3x104cells/Cm2)。
(注意:若使用其他培養(yǎng)器皿,請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整體積。)
2. 置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3. 分化:培養(yǎng)24h后即細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí),將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除,每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基。
(注意:若細(xì)胞融合度<80%,繼續(xù)再培養(yǎng)一天。)
4. 置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-21天,每2-3天換液。
(注意:培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng),越容易礦化,ARS染色更明顯。)
5. 成骨評(píng)價(jià):使用2%的ARS染色液。
成脂
接種hMSC
1. 用MSC Attachment solution 預(yù)包被24孔盤,每孔加入0.5ml MSC NutriStem® XF,接種6x104 細(xì)胞 (3x104 cells/cm2)。注意:若使用其他培養(yǎng)器皿,請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整體積。
2. 置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
分化
1. 培養(yǎng)24h后即細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí),將MSC NutriStem® XF 培養(yǎng)基吸除,每孔加入0.5ml分化培養(yǎng)基。
注意:若細(xì)胞融合度<80%,繼續(xù)再培養(yǎng)一天。
2. 置于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天,參照以下建議的替代培養(yǎng)基。
根據(jù)hMSC類型的替代培養(yǎng)基方法
不同來(lái)源的hMSC具有不同的多向分化潛能。例如,hMSC-AT需要較短的誘導(dǎo)期(~ 6天),而比hMSC-BM和hMSC-CT需要10天誘導(dǎo)期。
注意:對(duì)于所有不同類型的hMSC,誘導(dǎo)成脂后建議使用維持培養(yǎng)基。避免將液體直接加入到脂肪細(xì)胞上,需要非常小心移液,因?yàn)橹炯?xì)胞是脆弱的。
hMSC-AT:
一個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基
6-8天使用*成脂分化培養(yǎng)基,建議每3-4天換液。
成脂誘導(dǎo)完成后,用維持培養(yǎng)基MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基,培養(yǎng)3-4天。
hMSC-BM:
一個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基
8-12天使用*成脂分化培養(yǎng)基,建議每3-4天換液(0.5 ml/well)。
成脂誘導(dǎo)完成后,用維持培養(yǎng)基(MSC NutriStem® XF替代分化培養(yǎng)基,培養(yǎng)3-4天。
hMSC-CT:
至少兩個(gè)分化周期/維持培養(yǎng)基
5-10天使用*成脂分化培養(yǎng)基,建議每3-4天換液(0.5 ml/well)。
成脂誘導(dǎo)完成后,用維持培養(yǎng)基替代分化培養(yǎng)基,培養(yǎng)3-6天,每2-4天換液。
重復(fù)培養(yǎng)周期直到觀測(cè)到成熟脂肪細(xì)胞(即脂滴的形成)。
成軟骨
1. 接種hMSC,3D培養(yǎng)在 96-well U-bottom培養(yǎng)板中每孔加入100μl MSC NutriStem® XF,接種1x105細(xì)胞 (30-40x104 cells/cm2)。無(wú)需預(yù)包被。
注意:微量培養(yǎng)技術(shù)也是一個(gè)選擇并且可以激發(fā)球形細(xì)胞的形成:接種10μl 1x104cells/ml 入板的中心(MAX終1x105cells/well),使其貼壁2小時(shí),然后加入培養(yǎng)基0.1ml/well。
2. 置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在24-48小時(shí)內(nèi)會(huì)自發(fā)形成球狀體。
3. 分化:培養(yǎng)24小時(shí)后,將MSC NutriStem® XF培養(yǎng)基吸除,每孔加入0.2ml分化培養(yǎng)基。
4. 置于37°C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14-21天。
注意:培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),將得到更成熟的軟骨細(xì)胞(Alcian Blue染色強(qiáng)度更大)。
5. 每3-4天更換分化培養(yǎng)基(0.2ml/well)。
注意:小心不要吸入球狀體。
以上設(shè)備詳情,請(qǐng)咨詢上海喆圖儀器廠
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